微波辐射下酸功能化离子液体催化水解甾体皂苷为薯蓣皂苷元
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引言
药用植物盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright，DZW）属于薯蓣科，广泛分布于中国的山西、湖北和云南等省（Zhang等人，2012）。其根茎是一种著名的中药。它是薯蓣皂苷元（diosgenin）的主要来源，薯蓣皂苷元是甾体激素药物如口服避孕药、性激素和其他类固醇的半合成起始原料（Oncina等人，2000）。近年来，薯蓣皂苷元的各种药用用途，包括抗血栓作用（Gong等人，2011）、抗氧化（Rajalingam等人，2012）、对癌细胞的抗增殖和抗侵袭作用（Mao等人，2012），已被报道。
在薯蓣属植物中，薯蓣皂苷元以皂苷的形式储存，皂苷被认为是DZW的主要活性成分（Liu等人，2010a，b，c）。皂苷通过CeO糖苷键与葡萄糖或鼠李糖连接到苷元上（Zhang等人，2006）。工业上的薯蓣皂苷元主要通过这些糖苷键的盐酸水解制备。然而，在薯蓣皂苷元的工业生产过程中，排放出大量低pH和高化学需氧量（COD）的废水，导致严重的环境污染。此外，无机酸水解中的氯化反应等二次反应降低了薯蓣皂苷元的产量。
为了减少环境污染，许多将甾体皂苷转化为薯蓣皂苷元的水解技术已被研究以取代无机酸水解技术。里氏木霉（Zhu等人，2010）、哈茨木霉（Liu等人，2010a，b，c）和米曲霉（Dong等人，2010）可以产生污染较少的薯蓣皂苷元。微生物合成一系列糖苷酶来水解甾体皂苷。由于其成本低和植物中淀粉的综合利用方式，植物材料的直接微生物转化方法已被广泛应用。淀粉在酸性条件下不水解，但在酸性条件下可以被微生物充分利用。它大大减少了高COD的排放。然而，在生物转化过程中，原始草药中的多底物和酶没有得到彻底研究，并且没有获得高转化率（Dong等人，2010）。此外，生物转化是无方向的转化，微生物在生物转化过程中会产生许多中间产物。在目标组分的分离和纯化过程中消耗大量有机溶剂。与传统方法相比，生物转化方法通常具有3 - 7天的长生产周期和低生产效率。因此，许多研究人员关注酶水解。通过来自烟曲霉的β - 葡萄糖苷酶（Lei等人，2012）或商业纤维素（Liu等人，2010a，b，c）从皂苷到薯蓣皂苷元进行酶水解。天然产物的酶水解是一种有效的方法，具有以下优点：特异性高、反应条件温和、环境友好。然而，这种方法需要酶的制备过程。然而，对特定糖苷键的低催化活性导致产量低。此外，由于成本高，这种方法无法应用于工业生产。
因此，有必要开发一种高效、方便、经济的转化方法。近年来，离子液体作为一种环境友好型溶剂，在许多领域取代传统有机溶剂方面显示出巨大潜力（Wu等人，2013；Naushad等人，2012；Yu等人，2011；Yi等人，2013）。离子液体由各种阳离子和阴离子组成，室温下的离子液体仍处于液态。因此，它们不挥发、不易燃，可与水和各种有机溶剂互溶（Wilkes，2004；Boschetti等人，2007）。与传统溶剂系统相比，离子液体显示出出色的设计能力。此外，离子液体可回收且环境相容，可减轻环境污染。因此，我们在水解反应中采用离子液体作为绿色催化剂。酸功能化的“”离子液体显示出优异的催化水解性能，并具有传统离子液体的特点。此外，由于引入了酸官能团，它还具有一些其他特性，如均匀的酸强度分布、高酸密度、可调酸度和持久酸度。
为了缩短反应时间，我们使用微波加热方法代替传统的热方法。微波因其加热效应能大大缩短反应时间，显著提高反应速率和产率而受到广泛关注（Huang等人，2006）。离子液体由一对离子组成，因此具有高密度的强偶极子，这使它们成为微波吸收的有前途的候选者（Shih等人，2011）。
据我们所知，微波辐射下酸功能化离子液体催化水解甾体皂苷尚未见报道。在本研究中，我们将离子液体与微波技术相结合，实现薯蓣皂苷元的高效清洁生产（图1）。此外，还研究了离子液体浓度、溶剂与固体的比例和水解时间等重要反应因素。还研究了回收方法。水解中使用的所有溶剂都是环境友好且可回收的。最后，将该方法与传统方法进行比较，以突出其优势。
图1. 微波辐射下酸功能化离子液体[BHSO3MIm]HSO4生产薯蓣皂苷元。（a）：甾体皂苷。（b）：薯蓣皂苷元。R：许多糖，如葡萄糖和鼠李糖。 -
实验
2.1. 材料
将盾叶薯蓣根茎在50℃下干燥，然后粉碎成粉末。总皂苷的制备方法基于Yang等人（2003）的报告。将干燥的根茎粉末与70％乙醇水溶液混合，在60℃下回流提取两次。然后过滤提取溶液，并在旋转蒸发器中浓缩以回收乙醇。将剩余的水溶液用正丁醇萃取三次以获得皂苷提取物。然后回收正丁醇并获得总甾体皂苷。
酸功能化离子液体1 - 磺丁基 - 3 - 甲基咪唑硫酸氢盐（[BHSO3MIm]HSO4，纯度> 99％）购自中国甘肃兰州化学物理研究所。薯蓣皂苷元标准品购自上海源叶生物科技有限公司（上海）。标准化合物的纯度高于99％。
色谱级乙腈购自国药化学试剂有限公司（上海）。用于HPLC（高效液相色谱）的所有溶剂均通过0.22μm微孔膜过滤。
石油醚和正丁醇均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司（上海）。
2.2. 仪器
XH - 800B智能微波工作站，输出功率为0 - 1000 W，购自北京祥鹄科技发展有限公司（北京）。反应混合物的温度被监测并保持恒定（±1℃）。一个正负控制旋转板放置在微波腔的底部，同时可以处理六个样品。在实际实验中，通过波动的微波功率使反应温度保持恒定。
Agilent 1100系列HPLC系统购自安捷伦（美国加利福尼亚州）。使用GraceSmart RP C18柱（5μm，4.6×250 mm，W. R. Grace & Co. - Conn，哥伦比亚，马里兰州，美国）。
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2.3. 微波辅助水解的优化
为了获得最佳水解效果，通过单因素分析方法研究并优化了四个实验参数，即离子液体浓度、溶剂与固体的比例、反应温度和反应时间。在实验中，将离子液体[BHSO3MIm]HSO4在烧杯中完全溶解在去离子水中，转移到容量瓶中，并稀释至不同浓度。然后称取0.3 g甾体皂苷，加入反应罐中，然后与一定体积的离子液体混合。反应在微波腔中通过预设程序在不同参数下进行。反应完成后，仪器立即自动启动冷却过程。冷却后，溶液过滤并用蒸馏水洗涤几次。过滤后的残留物在50℃下干燥，然后在索氏提取器中用石油醚提取3小时。溶剂提取物在旋转蒸发器中浓缩并干燥。然后将薯蓣皂苷元用甲醇溶解，然后通过0.22μm膜过滤。薯蓣皂苷元通过HPLC测定。
为了获得最佳水解效果，通过单因素分析方法研究并优化了四个实验参数，即离子液体浓度、溶剂与固体的比例、反应温度和反应时间。在实验中，将离子液体[BHSO3MIm]HSO4在烧杯中完全溶解在去离子水中，转移到容量瓶中，并稀释至不同浓度。然后称取0.3 g甾体皂苷，加入反应罐中，然后与一定体积的离子液体混合。反应在微波腔中通过预设程序在不同参数下进行。反应完成后，仪器立即自动启动冷却过程。冷却后，溶液过滤并用蒸馏水洗涤几次。过滤后的残留物在50℃下干燥，然后在索氏提取器中用石油醚提取3小时。溶剂提取物在旋转蒸发器中浓缩并干燥。然后将薯蓣皂苷元用甲醇溶解，然后通过0.22μm膜过滤。薯蓣皂苷元通过HPLC测定。
2.4. 回收实验
离子液体是可回收的。因此，还研究了离子液体的回收方法。每次反应后，通过过滤去除反应产物、不溶性薯蓣皂苷元和水中的皂苷。然后用饱和正丁醇对滤液进行两次萃取。在旋转蒸发器中浓缩并干燥正丁醇层，以回收溶剂并获得未反应或中间皂苷。正丁醇和皂苷被回收。底层是水、离子液体和较少杂质的混合物。去除水并真空干燥半小时后，得到略带黄色的离子液体，并用于下一次反应。此外，通过五次反应研究了[BHSO3MIm]HSO4的可回收性。
离子液体是可回收的。因此，还研究了离子液体的回收方法。每次反应后，通过过滤去除反应产物、不溶性薯蓣皂苷元和水中的皂苷。然后用饱和正丁醇对滤液进行两次萃取。在旋转蒸发器中浓缩并干燥正丁醇层，以回收溶剂并获得未反应或中间皂苷。正丁醇和皂苷被回收。底层是水、离子液体和较少杂质的混合物。去除水并真空干燥半小时后，得到略带黄色的离子液体，并用于下一次反应。此外，通过五次反应研究了[BHSO3MIm]HSO4的可回收性。
2.5. 常规方法
为了突出[BHSO3MIm]HSO4和微波辐射的效果，选择常规油浴或微波中的盐酸水解作为对照进行比较。根据常规油浴水解方法，将0.3 g皂苷与10 mL 2 mol/L盐酸混合，然后在油浴中于100℃下水解5小时（Liu等人，1995）。根据常规微波水解方法，将0.3 g甾体皂苷与2 mol/L盐酸（4.5 mL）混合，然后在微波辐射下于100℃下水解20分钟。所有样品在与微波辅助水解相同的条件下进行分析。
为了突出[BHSO3MIm]HSO4和微波辐射的效果，选择常规油浴或微波中的盐酸水解作为对照进行比较。根据常规油浴水解方法，将0.3 g皂苷与10 mL 2 mol/L盐酸混合，然后在油浴中于100℃下水解5小时（Liu等人，1995）。根据常规微波水解方法，将0.3 g甾体皂苷与2 mol/L盐酸（4.5 mL）混合，然后在微波辐射下于100℃下水解20分钟。所有样品在与微波辅助水解相同的条件下进行分析。
