引言
多糖作为生物大分子表现出多种独特的物理化学、生理和药物特性（Jiang等人，2013；Li等人，2014；MíˇcKoVá，ˇcopíKoVá，& SyNytSyA，2007）。大多数多糖是从植物、动物和微生物中获得的（Qu，Liu，& Zhang，2014；Vu，Chen，Crawford，& Ivanova，2009；Zia，Anjum，Zuber，Mujahid，& Jamil，2014）。然而，制备方法通常涉及大量的前期工作，如材料选择、提取、分离、纯化以获得目标产品，而多糖的产率较低。因此，一种简单、快速和高效的多糖合成方法是可取的。
先前的研究表明，在热和酸的存在下，糖可以聚合（Allingham，1982；Li，Le，& Shi，2006a；Manley - Harris & Richards，1993）。在糖的聚合中，酸催化单糖的羟基（C - 1）质子化作为糖基供体，非质子化的糖作为糖基受体。在微波辐射条件下，糖分子之间的糖苷键迅速有效地构建，为聚合提供能量。早期的一项研究成功地使用d - 葡萄糖作为反应物，酸作为催化剂，在微波辐射条件下合成了低聚糖（Li，Le，Cheng，Wang，& Shi，2006b）和聚葡萄糖（Wang，Shi，& Le，2014）。由于其良好的加工性能和潜在的健康益处，聚葡萄糖被广泛用作各种食品中的低能量填充剂，并部分替代脂肪和淀粉（Cerna等人，2003）。以前的研究表明，酸催化和微波介导的方法可能用于合成其他增值碳水化合物聚合物。由于d - 葡萄糖和d - 甘露糖的结构相似，d - 葡萄糖的聚合反应可能适用于d - 甘露糖。此外，含有d - 甘露糖的多糖具有许多特殊的生物功能。补充芦荟聚甘露糖的饮食已被证明对被诊断患有阿尔茨海默病的成年人有积极影响（Lewis等人，2013），而来自酵母细胞壁的甘露聚糖具有抗氧化和抗突变活性（Kriˇzková等人，2006）。
据我们所知，很少有研究调查通过酸催化下的微波辐射快速有效地合成聚甘露糖。为了探索新的多糖合成方法，本工作的目的是制备和表征聚甘露糖的结构。

材料和方法
2.1. 材料
使用去离子水和超纯水。除非另有说明，所有化学品均购自Sigma - Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。d - 甘露糖（AR级）购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）。所有其他化学品均为分析纯。
2.2. 聚甘露糖的制备
根据先前描述的方法（Wang等人，2014），通过微波辐射下的酸催化合成聚甘露糖。简而言之，将50 g d - 甘露糖加入到一个开放的玻璃容器中，然后加入6 mL质子浓度为2.5 mol/L的磷酸，并在玻璃容器中充分混合。然后将混合物放入XH - 200A微波反应器（北京祥鹄科技发展有限公司，北京，中国）的腔体内，在115℃下进行微波辐射（900 W）5 min，并不断搅拌。反应完成后，用干燥空气冷却混合物并粉碎，得到粗产物（合成途径如图1所示）。
2.3. 聚甘露糖产率的测定
通过峰面积积分法估算聚甘露糖的产率。使用Sugarpack - 1柱通过HPLC对合成产物进行分析，条件如下：水作为流动相，流速为0.4 mL/min，柱温保持在85℃，进样量为10μL。样品用示差折光检测器（Waters 2410）检测。
2.4. 聚甘露糖的纯化
将粗产物溶解在去离子水中，然后用五倍体积的乙醇沉淀，得到d - 甘露糖和无酸产物。将沉淀物重新溶解在去离子水中，在0.1 MPa的真空下于60℃进一步浓缩，然后冻干得到白色粉末。乙醇沉淀的聚甘露糖在室温下通过Sephadex G - 25凝胶柱的凝胶渗透色谱进一步纯化。收集洗脱液并冻干，作为纯化的聚甘露糖用于进一步分析。
2.5. 分子量测定
通过配备2410差分折射率（RI）检测器和Empower工作站（Waters，美国）的Waters 600 HPLC仪器，通过高效尺寸排阻色谱（HPSEC）测定聚甘露糖的分子量。分析柱为UltrahydrogelTM Linear 300 mm×7.8 mm id×2。洗脱液为含有NaN3（0.5 g/L）的NaNO2（0.1 mol/L）溶液，流速为0.9 mL/min。样品先前通过膜（0.22μm，Millipore）过滤，以1 mg/mL的浓度进样。柱温保持在45℃。
2.6. 单糖组成分析
通过处理样品（30 mg）在4 mL的2 M三氟乙酸（TFA）中于115℃下4.5 h，确定聚甘露糖的单糖组成。根据先前的方法（Wang，Liu，Zhou，& Hu，2012），使用ICS5000高性能阴离子交换色谱（HPAEC）（Dionex，美国）进行分析。
2.7. 傅里叶变换红外（FT - IR）光谱
在Nicolet 560光谱仪（Nicolet Co.，美国）上记录纯化的聚甘露糖和d - 甘露糖的傅里叶变换红外（FT - IR）光谱。将两个样品与相同剂量的固体溴化钾（KBr）粉末混合，并将混合物制成颗粒。在4000 cm−1至400 cm−1的透射模式下对KBr颗粒进行FTIR分光光度法测量和记录。
2.8. 甲基化分析
根据Hakomori（1964）的方法进行聚甘露糖的甲基化分析。将干燥样品（20 mg）在室温下在6 mL DMSO中孵育2 h使其溶解。在氩气吹扫下，逐份加入甲基亚磺酰阴离子，直到颜色褪色，在室温下持续2 h。然后将混合物转移到冰浴中，小心地吸取4 mL甲基化剂CH3I，并将混合物孵育3 h。最后加入水终止反应。将混合物透析24 h，并在氩气流下干燥。然后用甲酸（1 mL）在100℃下水解甲基化产物1 h。除去甲酸后，向样品中加入2 mL 4 M三氟乙酸（TFA）在安瓿瓶中，用氩气吹扫，密封，并在100℃下加热6 h。然后将混合物冷却，并在氩气流下干燥。将样品溶解在0.6 mL蒸馏水中，用硼氢化钠还原，用（1:1）吡啶 - 乙酸酐在100℃下乙酰化2 h。将所得的部分甲基化糖醇乙酸酯（PMAA）的等分试样注入GC - MS系统（Agilent，美国），该系统配备有TR - 35MS柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm，80 - 200℃，15℃/min，然后200 - 260℃，10℃/min）和铁阱MS检测器。
2.9. 1H，13C和2D NMR光谱
将聚甘露糖在70℃下搅拌溶解在4 mL D2O中2 h，然后冻干。这个过程重复三次。然后将样品溶解在3 mL D2O中。在Bruker DRX - 500光谱仪上，在25℃的样品温度下，分别在500.13和125.77 MHz下记录高分辨率的1H和13C NMR光谱。使用5 - mm反向几何1H/13C/15N探头。使用标准Bruker（Bruker，德国）脉冲序列进行同核1H - 1H相关光谱（COSY，TOCSY）和异核1H - 13C相关实验（HMQC，HMBC）。

结果与讨论
3.1. 温度、时间和质子对聚甘露糖合成的影响
使用d - 甘露糖作为反应物，磷酸作为催化剂，通过改进的途径在微波辐射的辅助下合成聚甘露糖。反应温度、反应时间和质子浓度对聚甘露糖产率的影响如下：
温度在聚甘露糖的合成速率和产率比中起着关键作用。在本研究中，聚甘露糖合成的最佳温度为115℃（图2a），在恒定微波功率输出900 W、反应时间5 min和质子浓度2.5 mol/L的条件下。
反应时间是有效合成的重要因素之一。因此，对聚甘露糖合成进行了5 min的时间进程研究（图2b），温度为115℃，质子浓度为2.5 mol/L。微波辐射5 min后，聚甘露糖的最大产率为91.46％。
磷酸用作催化剂以加速d - 甘露糖的聚合。如图（图2c）所示，聚甘露糖的产率随着质子浓度的增加而提高，直到达到约2.5 mol/L的峰值。其他最佳条件为反应温度115℃和反应时间5 min。
3.2. 聚甘露糖的单糖鉴定和分子量分析
用2 mol/L TFA水解乙醇沉淀的聚甘露糖4.5 h，然后通过HPAEC检测水解产物。如表1所示，乙醇沉淀的聚甘露糖的组成是d - 甘露糖和微量d - 葡萄糖。
纯化的聚甘露糖在HPGPC上洗脱为单一对称的尖锐峰，分子量分布系数（Mw/Mn）为1.16，表明纯化的聚甘露糖是均匀的。重均分子量（Mw）计算为2.457 kDa，数均分子量（Mn）为2.105 kDa，平均聚合度（DP）约为15。
表1 多糖的单糖组成和分子量。