心肌缺血再灌注（I/R）损伤通常发生在心肌血流受阻后再恢复缺血心脏的血液供应时（Zhou等，2015）。已知心肌I/R损伤会导致循环骤停、心脏手术或心肌缺血后出现各种不良心血管后果（Frank等，2012）。根据先前的研究，心肌I/R损伤是心血管疾病发展的主要原因，也是与冠状动脉闭塞相关的死亡率和发病率的主要原因（Li等，2016）。尽管已经应用了多种药物干预措施来为心肌I/R损伤主要引起的氧化应激提供心脏保护，但仍需要更有效的治疗方法来减少心肌I/R损伤并抑制不可逆细胞损伤的进展（Liu等，2014）。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3 - 激酶（PI3K）相关激酶家族的成员，形成两种不同的复合物，分别命名为mTORC1和mTORC2（Okamoto等，2016）。核因子 - κB（NF - κB）是一种普遍存在且重要的转录因子，具有多种刺激物，包括生长因子和细胞因子，可控制与免疫反应相关的多种基因的表达（Miller等，2014；Zhu等，2014）。Ahmad等还表明，NF - κB途径可以作为与各种下游和上游信号通路相互作用的关键中心途径，包括mTOR途径（Ahmad等，2013）。根据相关研究，NF - κB诱导与生存、生长、分化甚至神经细胞激活相关的基因的激活，如促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl - 2（Mattson，2005）。此外，自噬样细胞的死亡导致心肌缺血引起的脑损伤，其过程主要由mTOR/NF - κB调节（Chen等，2013；Li等，2013）。在各种实验中，高位胸段硬膜外麻醉（HTEA）已显示出对肠道功能、区域血流以及微血管灌注的保护作用，近年来HTEA已广泛应用于主要的心脏手术中（Enigk等，2014；Wang等，2016）。此外，HTEA已被报道可改善缺血性心脏病患者的心肌功能（Jakobsen等，2009）。综上所述，mTOR/NF - κB信号通路和HTEA均影响心肌I/R损伤。

因此，本研究旨在探讨mTOR/NF - κB信号通路在HTEA对抗大鼠心肌I/R损伤中的作用。

本研究经广西医科大学第一附属医院、广西心脑血管疾病精准医学重点实验室培育基地的实验动物使用和保护伦理委员会批准。

共90只健康成年雄性Sprague - Dawlay（SD）大鼠（270 ~ 330 g），由河北省实验动物中心提供（许可证号：SCXK（河北）2013 - 1 - 003）。所有大鼠均以正常饲料饲养，在室温（21℃ ~ 23℃）、恒定湿度（53% ~ 55%）下自由饮水和进食。每天按时供应充足的水，更换塑料，避免噪音和其他干扰。

将90只大鼠分为六组（每组15只）：正常组（正常健康大鼠）；假手术组，对大鼠进行左胸切开术，但不结扎左冠状动脉；I/R组，构建心肌I/R损伤大鼠模型；HTEA组，对I/R大鼠进行麻醉后分离皮下组织，分离韧带形成穿刺，将硬膜外导管的一端插入硬膜外腔，另一端用皮肤缝线固定在背部（如果导管的前端位于第3 ~ 4肋间间隙，则模型成功建立）；PDTC（吡咯烷二硫代氨基甲酸酯）组，在建立心肌I/R损伤模型前15分钟，腹腔注射PDTC（15 mg/kg；深圳晶美生物工程有限公司，深圳，中国），一种核因子κB（NF - κB）抑制剂；HTEA + PDTC组，在建立心肌I/R损伤模型前15分钟，腹腔注射PDTC（15 mg/kg；深圳晶美生物工程有限公司，深圳，中国），并在模型成功建立后进行HTEA，与HTEA组相同。

建立大鼠心肌I/R损伤模型。模型组60只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（15 mg/kg；上海泰瑞尔生物技术有限公司，上海，中国）麻醉15分钟。打开大鼠气管，插入导管连接动物呼吸机（ALC - V9；上海奥尔科特生物科技有限公司，上海，中国）进行正常呼吸，氧气浓度为33%。调整和维持呼吸频率和潮气量，使pH值在7.35 ~ 7.45之间，PaCO₂在25 ~ 40 mmHg之间，PaO₂在90 ~ 150 mmHg之间（1 mmHg = 0.133 kPa）。使用智能恒温控制器（成都泰盟科技有限公司，成都，中国）维持大鼠体温在36℃至37℃之间。在第五肋间进行左胸切口，打开心包，在左心耳下缘结扎左冠状动脉前降支（LAD）30分钟，在缝合线末端设置自制橡胶套。心电图显示ST段弓背抬高，结扎线下心肌变暗，左心室发绀，表明心肌缺血。松开结扎线后再灌注120分钟，心外膜充血表明再灌注成功，表明心肌I/R损伤大鼠模型成功建立。假手术组15只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg；上海泰瑞尔生物技术有限公司，上海，中国）麻醉15分钟，然后进行左胸切口，但不结扎左冠状动脉。正常组15只大鼠注射等体积生理盐水。

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（15 mg/kg，上海泰瑞尔生物技术有限公司，上海，中国）麻醉15分钟。采集六组大鼠的心脏静脉血（15 mL），收集到真空采血管中。分离血液样本的血清和血浆，并分别保存用于进一步实验。按照试剂盒的操作指南，采用双抗体夹心亲和素 - 生物素过氧化物酶复合物 - ELISA（ABC - ELISA）。使用ELISA试剂盒（森雄生物技术有限公司，上海，中国）检测肌酸激酶同工酶（CK - MB）、肌钙蛋白I（TnI）、肌钙蛋白T（TnT）、肌红蛋白（MYO）和N末端脑钠肽前体（NT - proBNP）的表达。

大鼠采血后10分钟处死，分离心脏。收集每组大鼠的左心室心肌组织并保存。将少量左心室心肌切成小块，脱蜡，然后进行梯度乙醇水化。水化后的组织切片浸入苏木精中5 ~ 20分钟进行细胞核染色。用流水冲洗3 ~ 5分钟后，用1%盐酸 - 乙醇溶液分化5 ~ 30秒。再用流水冲洗3分钟后，加入弱碱性水溶液30秒至1分钟进行返蓝。然后用流水冲洗5 ~ 10分钟，随后将水化切片浸入伊红溶液中染色细胞质。进行梯度乙醇脱水。最后，在封片后使用CX21光学显微镜（奥林巴斯光学有限公司，东京，日本）观察组织样本。

取大鼠心肌组织，从心尖到心底切成1 ~ 2 mm厚的切片，加入1% TTC溶液。将组织切片在37℃恒温水浴中浸泡20分钟，然后在10%甲醛中固定过夜。在显微镜下观察，梗死区呈灰色，而无梗死区呈红色。在解剖显微镜下分离梗死心肌组织和非梗死心肌组织，并计算其质量。心肌梗死的大小表示为心肌梗死质量占心肌质量的百分比（Kiss等，2016）。

左心室心肌组织用4%多聚甲醛（北京雷根生物技术有限公司，北京，中国）固定24小时，然后进行常规脱水、透明、石蜡包埋。将石蜡包埋的组织切成3 ~ 5μm厚的连续切片，脱蜡、水化，然后进行高压蒸煮进行抗原修复。组织切片用20μg/mL蛋白酶K在37℃下消化30分钟。加入H₂O₂在室温下孵育10分钟以灭活内源性过氧化物酶。切片用含有0.1% Triton X - 100的0.1%柠檬酸钠溶液渗透。在冰浴2分钟后，切片在37℃下与新鲜的反应溶液孵育1小时。

加入过氧化物酶标记的荧光素抗体在37℃下孵育30分钟，然后加入新鲜的二氨基联苯胺（DAB）在室温下显色。用苏木精对细胞核进行复染30秒。切片用0.5%盐酸 - 乙醇溶液分化并冲洗变蓝。用梯度乙醇脱水，用二甲苯透明，并用中性树胶封片。正常细胞核染成蓝色，凋亡细胞核染成深棕色。在光显微镜下（400×）随机选择每个切片的五个视野，计数阳性细胞的数量。凋亡指数（AI）指凋亡程度。AI = 凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%（Hu等，2016）。

使用RNA提取试剂盒（天根生物技术有限公司，北京，中国）从每组大鼠的心肌组织中提取总RNA。设计并合成了mTOR、NF - κB、核因子 - κB亚基（p50）、核因子 - κB亚基（p65）、fas配体（Fasl）、Bcl - 2相关X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病 - 2（Bcl - 2）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、BCL2/腺病毒E1B 19 kDa蛋白相互作用蛋白 - 3（BNIP3）、自噬相关基因5（Atg5）和甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）的引物序列（Takara生物技术有限公司，大连，中国）。根据Prime Script RT试剂盒（Takara生物技术有限公司，大连，中国）的说明，将转录（10μL）逆转录为cDNA。逆转录在37℃下反应45分钟，逆转录酶失活在85℃下反应5秒。使用SYBR® Premix Ex TaqTM II试剂盒（Takara生物技术有限公司，大连，中国）进行RT - qPCR。反应体系（共50μL）包括25μL的2×SYBR® Premix Ex TaqTM II（Takara生物技术有限公司，大连，中国）、2μL的PCR正向引物、2μL的PCR反向引物、1μL的50×ROX参考染料（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）、4μL的DNA模板和16μL的ddH₂O。使用ABI P.RISM® 7300系统（ABI公司，牡蛎湾，纽约）进行RT - qPCR。

反应条件如下：95℃预变性30秒，95℃变性5秒，60℃退火和延伸30秒，共40个循环。引物用二乙基焦碳酸酯（DEPC）水溶解至浓度为100μM，然后稀释至10μM，分装并储存在 - 20℃下。GAPDH作为内参。使用2 - ∆∆Ct方法计算组织中mTOR、p50、p65、Fasl、Bcl - 2、Bax、LC3、BNIP3和Atg5 mRNA的相对表达量（Wang等，2013）。

将每组大鼠的左心室心尖组织切成片，置于匀浆器底部。向样品中加入Western细胞裂解缓冲液（批号：P0013C；Beyotime生物技术有限公司，上海，中国）、苯甲基磺酰氟（PMSF，一种丝氨酸蛋白酶抑制剂）（上海春试生物技术有限公司，上海，中国）和酚磺基转移酶（PST，一种磷酸酶抑制剂）（Abcam贸易有限公司，上海，中国），然后使用超声细胞破碎仪（北京祥鹄科技发展有限公司，北京，中国）破碎三次，在低温下保持30分钟。细胞裂解后，将组织匀浆转移到1.5 mL Eppendorf（EP）管中。将组织匀浆（1500 g）在4℃下用离心机离心30分钟。收集上清液并分装到离心管中并低温保存。使用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（批号：P0012；Beyotime生物技术有限公司，上海，中国）检测组织中蛋白质的浓度。用细胞裂解液将蛋白质样品调整至相同的蛋白质浓度。将蛋白质样品与缓冲溶液混合并在95℃下煮沸5分钟以完全变性蛋白质，然后在低温冰箱中冷冻保存。使用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离每个样品的蛋白质（20mg），并转移到硝酸纤维素膜上。用5%脱脂牛奶封闭蛋白质2小时。加入一抗后，将蛋白质样品在4℃下孵育过夜：NF - κB（1:1000；#8242）、mTOR（1:1000；#5536）、p50（1:1000；#13586）、p65（1:1000；#8242）、Bax（1:1000；#14796）、Bcl - 2（1:1000；#3498）、LC3 - I（1:1000；#4599）、LC3 - II（1:1000；#3868）、BNIP3（1:1000；#12396）、Atg5（1:1000；#12994）（均来自Cell Signaling Technologies，贝弗利，马萨诸塞州，美国）、FasL（1:1000；ab15285；Abcam公司，剑桥，马萨诸塞州，美国）和GAPDH（1:1000；#5174；Cell Signaling Technologies，贝弗利，马萨诸塞州，美国）。样品用Tris缓冲盐水吐温 - 20（TBST）冲洗三次。加入二抗后，样品孵育2小时。使用增强化学发光（ECL）试剂盒（中科生物试剂有限公司，上海，中国）显影。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜加入化学发光试剂A和B溶液（中科生物试剂有限公司，上海，中国）并在暗室中保存。

曝光后，使用自动处理器对样品进行显影和固定。GAPDH作为内参，使用BandScan 5.0软件（Glyko公司，深圳，中国）分析蛋白质条带。蛋白质的相对表达量显示为目标蛋白与内参的灰度值比。