超声与微波协同作用对转谷氨酰胺酶交联乳清分离蛋白结构和功能特性的影响
摘要：
本研究应用超声（400 W，U）、微波加热（75℃，15分钟，M）和超声与微波协同加热（UM）对乳清分离蛋白（WPI）进行预处理，以探究并比较它们对转谷氨酰胺酶（TGase）诱导的WPI的结构、理化及功能特性的影响。尺寸排阻色谱结果表明，所有三种物理预处理均能促进TGase交联的WPI中聚合物的形成，聚合物的数量按U、UM和M预处理的顺序增加。在这三种物理方法中，M预处理对TGase诱导的WPI的结构和功能特性影响最强。此外，与TGase诱导的WPI相比，M处理的TGase诱导的WPI（M - WPI - TGase）的α - 螺旋和β - 转角分别减少了7.86%和2.93%，而其β - 折叠和不规则卷曲分别增加了15.37%和7.23%。M - WPI - TGase的Zeta电位、乳液稳定性和泡沫稳定性分别增加了7.8%、59.27%和28.95%。本实验表明，对于WPI，M是比U和UM更有效的预处理方法，能够促进其与TGase的反应并改善其功能特性。
本研究应用超声（400 W，U）、微波加热（75℃，15分钟，M）和超声与微波协同加热（UM）对乳清分离蛋白（WPI）进行预处理，以探究并比较它们对转谷氨酰胺酶（TGase）诱导的WPI的结构、理化及功能特性的影响。尺寸排阻色谱结果表明，所有三种物理预处理均能促进TGase交联的WPI中聚合物的形成，聚合物的数量按U、UM和M预处理的顺序增加。在这三种物理方法中，M预处理对TGase诱导的WPI的结构和功能特性影响最强。此外，与TGase诱导的WPI相比，M处理的TGase诱导的WPI（M - WPI - TGase）的α - 螺旋和β - 转角分别减少了7.86%和2.93%，而其β - 折叠和不规则卷曲分别增加了15.37%和7.23%。M - WPI - TGase的Zeta电位、乳液稳定性和泡沫稳定性分别增加了7.8%、59.27%和28.95%。本实验表明，对于WPI，M是比U和UM更有效的预处理方法，能够促进其与TGase的反应并改善其功能特性。
1. 引言
转谷氨酰胺酶（TGase，EC 2.3.2.13）通常可通过微生物发酵获得，它能催化蛋白质中谷氨酰胺（作为酰基供体）残基和赖氨酸（作为酰基受体）残基之间的催化酰基转移反应、脱酰胺反应和交联聚合。TGase修饰的食品蛋白质的结构和功能已被广泛研究，如大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等。然而，天然的α - 乳白蛋白和β - 乳球蛋白是紧密的球状蛋白，这阻碍了它们的TGase反应位点暴露，导致TGase与WPI的反应降低。因此，有必要改变乳清蛋白的结构，以便使其与TGase更容易交联。
超声（U）已被证实是一种能改变蛋白质结构和功能特性的新技术，此外，它是一种不含有外源化学添加剂的环境友好型技术。例如，Cheng等人发现，在20/28 kHz下处理10分钟的乳清蛋白乳液凝胶的凝胶特性显著增强。大豆分离蛋白（SPI）在400 W超声处理40分钟后与TGase交联，可增强SPI的凝胶特性并提高核黄素的包埋率，还能显著降低核黄素在后续消化过程中的释放率。Nazari等人证明，经过20 kHz超声处理5、12.5和20分钟后，小米浓缩蛋白的溶解性、乳化特性、发泡能力和发泡稳定性显著增强。有报道称，超声（40 kHz，300 W）可用于促进TGase诱导的SPI和小麦面筋混合物的凝胶特性。超声对液体系统的影响可能与声空化现象有关，在超声过程中，空化气泡迅速形成并剧烈崩溃。在蛋白质溶液中，更多反应位点的暴露通过空化效应和超声预处理的剪切应力导致交联反应增加。众所周知，蛋白质在超声预处理后会产生大量自由基，此外，据报道，自由基可引起蛋白质结构修饰和氧化降解。
微波（M）是频率范围在0.3 - 300 GHz的电磁波。微波加热（2450 MHz）是一种介电处理方法，广泛应用于食品工业。M诱导修饰的潜在机制主要考虑温度的快速升高和电磁效应。微波场中的电磁效应可以重新排列电场分布，破坏电残基之间的静电相互作用，从而有助于蛋白质的解离和稳定。此外，据报道，活性自由基的形成也是微波诱导修饰的原因之一。有报道称，M可以改变虾蛋白的二级结构，增加β - 折叠，减少β - 转角。在微波加热（30℃）下形成的TGase诱导的乳蛋白的聚合速率是在相同温度下通过常规加热的三倍。此外，Qin等人发现，随着微波功率（0 - 700 W）的增加，M处理显著提高了大豆蛋白和小麦蛋白经TGase诱导后的凝胶强度、持水力和储能模量。上述众多研究表明，单一的微波加热或超声可以促进TGase与食品蛋白质的反应。尽管超声和微波的机制完全不同，但学者们先前已经证明，微波和超声（UM）预处理之间的协同作用在生物材料的开发和天然产物的提取中起着至关重要的作用。此外，据报道，微波辐射可以迅速渗透到复杂结构的内部，这是空化无法实现的，微波效应有助于加速超声处理的蛋白质的结构变化。因此，UM预处理可能是比单独的M和U预处理更好的修饰方法。然而，超声和微波的协同处理是否会促进WPI与TGase的交联反应，或增强WPI的功能特性仍不清楚。因此，本研究的目的是比较三种物理预处理（微波辅助超声（UM）、单独微波和超声）对TGase诱导的WPI的结构和功能特性的影响。这些发现将为有效的蛋白质修饰方法和制备具有更好功能特性的乳清蛋白提供技术数据支持。此外，为食品工业提供了一种具有优异功能特性的新型食品成分。
转谷氨酰胺酶（TGase，EC 2.3.2.13）通常可通过微生物发酵获得，它能催化蛋白质中谷氨酰胺（作为酰基供体）残基和赖氨酸（作为酰基受体）残基之间的催化酰基转移反应、脱酰胺反应和交联聚合。TGase修饰的食品蛋白质的结构和功能已被广泛研究，如大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等。然而，天然的α - 乳白蛋白和β - 乳球蛋白是紧密的球状蛋白，这阻碍了它们的TGase反应位点暴露，导致TGase与WPI的反应降低。因此，有必要改变乳清蛋白的结构，以便使其与TGase更容易交联。
超声（U）已被证实是一种能改变蛋白质结构和功能特性的新技术，此外，它是一种不含有外源化学添加剂的环境友好型技术。例如，Cheng等人发现，在20/28 kHz下处理10分钟的乳清蛋白乳液凝胶的凝胶特性显著增强。大豆分离蛋白（SPI）在400 W超声处理40分钟后与TGase交联，可增强SPI的凝胶特性并提高核黄素的包埋率，还能显著降低核黄素在后续消化过程中的释放率。Nazari等人证明，经过20 kHz超声处理5、12.5和20分钟后，小米浓缩蛋白的溶解性、乳化特性、发泡能力和发泡稳定性显著增强。有报道称，超声（40 kHz，300 W）可用于促进TGase诱导的SPI和小麦面筋混合物的凝胶特性。超声对液体系统的影响可能与声空化现象有关，在超声过程中，空化气泡迅速形成并剧烈崩溃。在蛋白质溶液中，更多反应位点的暴露通过空化效应和超声预处理的剪切应力导致交联反应增加。众所周知，蛋白质在超声预处理后会产生大量自由基，此外，据报道，自由基可引起蛋白质结构修饰和氧化降解。
微波（M）是频率范围在0.3 - 300 GHz的电磁波。微波加热（2450 MHz）是一种介电处理方法，广泛应用于食品工业。M诱导修饰的潜在机制主要考虑温度的快速升高和电磁效应。微波场中的电磁效应可以重新排列电场分布，破坏电残基之间的静电相互作用，从而有助于蛋白质的解离和稳定。此外，据报道，活性自由基的形成也是微波诱导修饰的原因之一。有报道称，M可以改变虾蛋白的二级结构，增加β - 折叠，减少β - 转角。在微波加热（30℃）下形成的TGase诱导的乳蛋白的聚合速率是在相同温度下通过常规加热的三倍。此外，Qin等人发现，随着微波功率（0 - 700 W）的增加，M处理显著提高了大豆蛋白和小麦蛋白经TGase诱导后的凝胶强度、持水力和储能模量。上述众多研究表明，单一的微波加热或超声可以促进TGase与食品蛋白质的反应。尽管超声和微波的机制完全不同，但学者们先前已经证明，微波和超声（UM）预处理之间的协同作用在生物材料的开发和天然产物的提取中起着至关重要的作用。此外，据报道，微波辐射可以迅速渗透到复杂结构的内部，这是空化无法实现的，微波效应有助于加速超声处理的蛋白质的结构变化。因此，UM预处理可能是比单独的M和U预处理更好的修饰方法。然而，超声和微波的协同处理是否会促进WPI与TGase的交联反应，或增强WPI的功能特性仍不清楚。因此，本研究的目的是比较三种物理预处理（微波辅助超声（UM）、单独微波和超声）对TGase诱导的WPI的结构和功能特性的影响。这些发现将为有效的蛋白质修饰方法和制备具有更好功能特性的乳清蛋白提供技术数据支持。此外，为食品工业提供了一种具有优异功能特性的新型食品成分。
2. 材料和方法
2.1. 材料
WPI（蛋白质含量93.5%）购自Mullins Whey Inc.（美国威斯康星州莫斯内）。转谷氨酰胺酶（酶活性1000 U/g蛋白）购自一鸣生物制品有限公司。D - 柠檬烯购自MAYA公司。十二烷基硫酸钠（SDS）、三氟乙酸（TFA）、三羟甲基氨基甲烷（tris）购自Sigma - Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。邻苯二甲醛购自Biotopped Technology Co.，Ltd（中国北京）。三氯乙酸购自天津广福精细化工研究所。溴化钾（KBr）购自Macklin Biochemical Co.，Ltd（中国上海）。本研究中使用的所有化学试剂均为分析纯。
2.2. 三种物理方法制备的WPI的制备
将WPI溶解在蒸馏水中，在室温下磁力搅拌2小时，配置成浓度为50 mg/mL的WPI溶液。随后，用1 mol/L NaOH调节WPI悬浮液的pH至7。
2.2.1. 超声处理的WPI的制备
使用XH - 300PE超声微波组合合成器对WPI悬浮液进行超声处理。超声处理（25 kHz）在400 W下进行15分钟。为了在超声过程中保持约22 ± 3℃，将WPI样品浸入冰浴中，并将程序设置为工作2分钟，然后停止1分钟。超声处理后的WPI样品标记为U - WPI。
2.2.2. 微波处理的WPI的制备
使用XH - 300PE超声微波组合合成器在75℃下对WPI溶液进行单独微波加热15分钟。微波加热后的样品随后冷却至室温并标记为M - WPI。
2.2.3. 超声和微波处理的WPI的制备
将超声功率设置为400 W，频率设置为25 kHz，微波加热温度设置为75℃，同时将WPI溶液加载到三颈烧瓶中，并在超声和微波共同作用下于75℃加热15分钟。在此期间，超声与微波协同的程序设置为工作2分钟 - 暂停2分钟，以保持反应温度在75℃。上述处理后的WPI样品冷却至室温后标记为UM - WPI。
2.2.4. 物理预处理前暴露的TGase诱导的WPI的制备
将30 U/g TGase添加到经不同物理预处理（U - WPI、M - WPI、UM - WPI）修饰的WPI溶液中，并将所得WPI置于50℃水浴中4小时，以确保WPI与TGase充分反应。4小时后，将它们置于75℃水浴中15分钟以使TGase失活。随后，将样品在冰水浴中冷却至室温并冷冻干燥。上述WPI样品记录为U - WPI - TGase、M - WPI - TGase和UM - WPI - TGase。对照组为TGase诱导的WPI（WPI - TGase）和经三种不同物理预处理的WPI。
2.1. 材料
WPI（蛋白质含量93.5%）购自Mullins Whey Inc.（美国威斯康星州莫斯内）。转谷氨酰胺酶（酶活性1000 U/g蛋白）购自一鸣生物制品有限公司。D - 柠檬烯购自MAYA公司。十二烷基硫酸钠（SDS）、三氟乙酸（TFA）、三羟甲基氨基甲烷（tris）购自Sigma - Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。邻苯二甲醛购自Biotopped Technology Co.，Ltd（中国北京）。三氯乙酸购自天津广福精细化工研究所。溴化钾（KBr）购自Macklin Biochemical Co.，Ltd（中国上海）。本研究中使用的所有化学试剂均为分析纯。
2.2. 三种物理方法制备的WPI的制备
将WPI溶解在蒸馏水中，在室温下磁力搅拌2小时，配置成浓度为50 mg/mL的WPI溶液。随后，用1 mol/L NaOH调节WPI悬浮液的pH至7。
2.2.1. 超声处理的WPI的制备
使用XH - 300PE超声微波组合合成器对WPI悬浮液进行超声处理。超声处理（25 kHz）在400 W下进行15分钟。为了在超声过程中保持约22 ± 3℃，将WPI样品浸入冰浴中，并将程序设置为工作2分钟，然后停止1分钟。超声处理后的WPI样品标记为U - WPI。
2.2.2. 微波处理的WPI的制备
使用XH - 300PE超声微波组合合成器在75℃下对WPI溶液进行单独微波加热15分钟。微波加热后的样品随后冷却至室温并标记为M - WPI。
2.2.3. 超声和微波处理的WPI的制备
将超声功率设置为400 W，频率设置为25 kHz，微波加热温度设置为75℃，同时将WPI溶液加载到三颈烧瓶中，并在超声和微波共同作用下于75℃加热15分钟。在此期间，超声与微波协同的程序设置为工作2分钟 - 暂停2分钟，以保持反应温度在75℃。上述处理后的WPI样品冷却至室温后标记为UM - WPI。
2.2.4. 物理预处理前暴露的TGase诱导的WPI的制备
将30 U/g TGase添加到经不同物理预处理（U - WPI、M - WPI、UM - WPI）修饰的WPI溶液中，并将所得WPI置于50℃水浴中4小时，以确保WPI与TGase充分反应。4小时后，将它们置于75℃水浴中15分钟以使TGase失活。随后，将样品在冰水浴中冷却至室温并冷冻干燥。上述WPI样品记录为U - WPI - TGase、M - WPI - TGase和UM - WPI - TGase。对照组为TGase诱导的WPI（WPI - TGase）和经三种不同物理预处理的WPI。
